Seit Jahrzehnten ist das Aufhellen und Färben mit Alcianblau und Alizarinrot der Goldstandard für die Darstellung der Skelettentwicklung von Wirbeltieren. In ihrer nun veröffentlichten Studie präsentiert ein Forschungsteam der Vetmeduni Vienna einen neuen Workflow für die Visualisierung und Analyse der Skelettentwicklung mittels mikroskopischer Computertomographie (microCT). Dadurch können echte 3D-Daten des gesamten sich entwickelnden Skeletts mit einer Auflösung von Mikrometern erfasst werden. „Unsere Methode bietet WissenschafterInnen zum ersten Mal die Möglichkeit, die Entwicklung von Knorpeln und Knochen im Mäuseembryo simultan und effektiv in 3D zu studieren. Zudem können wir in die Auswertung auch die Entwicklung anderer innerer Organe wie Gehirn oder Verdauungstrakt miteinbeziehen“, erklärt Erstautorin Simone Gabner von der Arbeitsgruppe Histologie und Embryologie des Instituts für Pathologie der Vetmeduni Vienna. „Die neue Methode ermöglicht sowohl die Visualisierung und qualitative Beurteilung der Skelettentwicklung als auch eine umfangreiche quantitative Analyse, also Messungen zu Größe und Form einzelner Skelettelemente“, so Gabner weiter.
Rutheniumrot als neues Kontrastmittel
Das neuartige Protokoll basiert auf der Ethanolfixierung und Färbung mit Rutheniumrot. Dieser röntgendichte Farbstoff kontrastiert effizient die Knorpelmatrix, wie die ForscherInnen an Mausfeten und Hühnerembryonen zeigen konnten. Das Knochenmineral bleibt während der Färbung gut erhalten, so dass das gesamte embryonale Skelett mit hohem Kontrast abgebildet werden kann. Ebenfalls neu in diesem Kontext ist das eingesetzte Mehrfachenergie-Verfahren (sogenanntes Dual-Energy CT). Diese Technologie erlaubt die farbliche Trennung von Knorpel und Knochen, wodurch sich farbige Röntgenbilder generieren lassen – ganz im Gegensatz zu den allseits bekannten schwarz-weißen Röntgenbildern. Dazu Stephan Handschuh von der VetCore/Imaging Unit: „Üblicherweise erzeugt die microCT Schwarz-Weiß-Bilder, wobei virtuelle Schnittbilder basierend auf einer Serie von Röntgenbildern errechnet werden. Mittels Dual-Energy CT können wir seit einigen Jahren mehrfärbige microCT-Daten generieren, so dass in Kombination mit unserer neuen Methode Knorpel und Knochen aufgrund Ihrer Röntgeneigenschaften farblich unterscheidbar sind.“
Leistungsstarke und vielseitige Erweiterung des derzeit verfügbaren Toolkits
Laut den ForscherInnen ist das neue Protokoll einfach und gut reproduzierbar. Demnach ist der Knorpelkontrast bei Mausfeten für eine schnelle visuelle Phänotypisierung ausreichend und morphometrische Skelettparameter lassen sich leicht extrahieren. Handschuh resümiert: „Wir betrachten den vorgestellten Workflow als eine leistungsstarke und vielseitige Erweiterung des derzeit verfügbaren Toolkits für die qualitative und quantitative Phänotypisierung der Skelettentwicklung von Wirbeltieren etwa zum Studium von Fehlbildungen oder bei der Einstufung zur Entwicklungstoxizität von Stoffen.“
Interdisziplinäre Zusammenarbeit als Erfolgsgrundlage
Für die Entwicklung der neuen Methode war ausschlaggebend, dass die ForscherInnen der drei involvierten Institute der Vetmeduni Vienna ihre unterschiedlichen Kernexpertisen eingebracht haben: Die Arbeitsgruppe Histologie und Embryologie des Instituts für Pathologie hat ein breites Wissen durch langjährige Forschungsprojekte zur Knorpelbiologie und in den histologischen Färbetechniken für Knorpelgewebe. Die Labortierkunde konnte ihre langjährige Erfahrung in der Mäusezucht und in der Generierung von Mausmodellen in das Forschungsprojekt einbringen. Und die VetCore/Imaging Unit kann auf langjährige Erfahrung in der Entwicklung neuer Röntgenkontrasttechniken verweisen und ist eine der international führenden Arbeitsgruppen im Bereich der mikroskopischen Dual-Energy CT.
